南京地下鐵道有限責任公司運營分公司是負責南京地鐵運營工作的實體，隸屬于南京地下鐵道有限責任公司。運營分公司是模擬市場化運作，內部獨立核算的企業，公司根據“適應市場經濟要求，產權清晰、權責明確、政企分開、管理科學”的現代企業制度要求，實行總經理負責制，設有客運部、車輛部、物資設施部、票卡清分部、財務審計部、勞動人事部、企業管理部、教育培訓部、技術部、安全保衛部、辦公室（黨政合署）等職能部門，各部門分工協作，全面承擔著公司的運營和管理工作。另設有站務中心、乘務中心、票務中心、控制中心、檢修一中心、檢修二中心、設備中心、工務中心、通號中心、供電中心、物資中心、信息中心、機電和自動化中心等13個中心，中心下面還按照專業設有工區，具體負責運營一線的客運、車輛、設備維護保養等各項工作。運營分公司一號線編制人員998人，為接管二號線、一號線南延線和二號線東延線，至2009年底，運營分公司人員編制擴大到3000人。 
       運營分公司成立后首先接手運營的項目為南京地鐵一號線一期工程，主要負責地鐵一號線的運營工作，包括運營管理、列車運行、控制監督、員工培訓及對土建設施、車輛和運營設備的保養、維修等。地鐵開通后運營分公司直接面向市民，已成為南京地鐵與市民直接交流的一個重要窗口。